Los investigadores de Irig demostraron el concepto de una prueba de cuantificación molecular sensible y libre de anticuerpos que combina la especificidad de los aptámeros y la sensibilidad de la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP). Su estudio demuestra que este innovador ensayo apta-LAMP podría ser relevante para la detección de diferentes tipos de biomarcadores y su cuantificación a niveles fisiológicos. Allanaría el camino para las pruebas moleculares sin anticuerpos.
Los biomarcadores sanguíneos son moléculas que señalan, por ejemplo, la presencia de una enfermedad (La enfermedad es una alteración en las funciones o la salud de un organismo vivo, animal, etc.), y esto con alta sensibilidad y especificidad. Su detección es de suma importancia para detectar mejor los signos predictivos o precoces de determinadas enfermedades. Existen varias técnicas, pero la cuantificación de un objetivo como un biomarcador presente en concentraciones muy bajas en una muestra (en general, una muestra es una pequeña cantidad de un material, información o…) complejo (sangre, orina, agua contaminada etc.) actualmente sigue siendo un desafío.
Se han desarrollado varias técnicas, incluyendo ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) que utiliza dos anticuerpos diferentes y amplificación enzimática. Sin embargo, ELISA a veces es limitado o incluso ineficaz cuando el objetivo está presente en concentraciones muy bajas. Mientras que la amplificación enzimática es lineal en el tiempo (el tiempo es un concepto desarrollado por los humanos para aprehender…), se han desarrollado amplificaciones exponenciales basadas en oligonucleótidos (cerebros cortos de ADN o ARN sintético) y son la base de la técnica PCR. Existen dos variantes del ELISA:
– inmuno-PCR, cuando se sustituye la amplificación enzimática de ELISA por una amplificación exponencial (La función exponencial es una de las aplicaciones más importantes en análisis, o más…) de ADN por PCR todo (El conjunto entendido como el conjunto de lo que existe a menudo se interpreta como el mundo o…) preservando el reconocimiento del biomarcador por anticuerpos, y.
– se sustituye el apta-PCR o uno de los dos anticuerpos por un aptámero al que se le injerta una secuencia nucleotídica corta para la amplificación por PCR. Sin embargo, la inmuno-PCR requiere dos anticuerpos específicos para el objetivo deseado, así como el desarrollo de un anticuerpo conjugado (en matemáticas, el conjugado de un número complejo z es el número complejo formado por…) al ADN, lo que lo hace complicado. y caro. El uso de aptámeros como sustituto de los anticuerpos hace que la apta-PCR sea muy interesante, especialmente en medios complejos.
Sin embargo, estas dos variantes tienen las desventajas de la amplificación por PCR, a saber, la necesidad de trabajar a varias temperaturas y una alta sensibilidad a los inhibidores presentes en las muestras a estudiar. La amplificación isotérmica mediada por bucle, o LAMP (LAMP es un acrónimo que designa un conjunto de software libre que permite la construcción de…), representa entonces una alternativa interesante. Es uno de los métodos más específicos y sensibles entre las amplificaciones isotérmicas, además es menos sensible a los inhibidores presentes en las muestras biológicas y tiene la ventaja de realizarse a temperatura (la temperatura es una magnitud física medida con un termómetro y…) constante.
Los investigadores del Irig han demostrado el concepto de una prueba apta-LAMP utilizando trombina (una proteína (una proteína es una macromolécula biológica compuesta por uno o más…) implicada en la coagulación) como biomarcador. Por lo tanto, utilizaron dos aptámeros descritos para unirse a dos epítopos diferentes de esta proteína para formar un sándwich estable (Figura). El test desarrollado se basa en la amplificación del ADN mediante una estructura en forma de pesa (Patent) que requiere solo 2 cebadores en lugar de 4 o 6. De forma original, los investigadores introdujeron una secuencia de aptámeros en diferentes posiciones de la estructura en pesa para analizar la impacto en la amplificación y el reconocimiento de la trombina. La amplificación de estos diferentes alters se validó en menos de 30 minutos (Forma primaria de un documento: Derecha: un minuto es el original de un…) y la detección cuantitativa de trombina se realizó con un límite de detección de 100 pM y un rango de cuantificación de 3 órdenes de magnitud correspondientes a condiciones fisiológicas.
La muestra en la que se busca la presencia de un biomarcador (aquí la proteína trombina) se pone inicialmente en contacto con perlas magnéticas sobre las que se injerta un primer aptámero que presenta afinidad con la trombina. A continuación se añade la estructura en mancuerna que comprende el segundo aptámero y formará un sándwich con la trombina si esta última está presente en la muestra a analizar. A continuación, se realizará una amplificación LAMP en presencia de 2 cebadores y luego se cuantificará la diana.
Este método, que no requiere el uso de anticuerpos, puede integrarse en un dispositivo médico portátil y permite cuantificar diversos biomarcadores con alta especificidad y sensibilidad, a partir de muestras clínicas, en situaciones adaptadas a un denominado análisis de cabecera (In el campo de la medicina, el término paciente comúnmente designa a una persona que recibe…). Los investigadores trabajan actualmente en la detección de dos biomarcadores sanguíneos cardíacos, la troponina (la troponina es un complejo de proteínas que sensibilizan las células musculares a…) y el NT-proBNP, lo que abre perspectivas en el campo del diagnóstico (El diagnóstico (desde el Griego δι?γνωση, diágnosi, de…), en particular para su aplicación a las enfermedades del corazón que requieren un diagnóstico rápido. Es en esta capacidad que la región de Auvergne Rhône-Alpes apoya esta investigación a través del proyecto ( Un proyecto es un compromiso irreversible de resultado incierto, no reproducible a…) DEDICAR.
Notas:
PCR: Polymerase Chain Reaction es una reacción de polimerización en cadena del ADN (La polimerasa se refiere a la reacción química, o al proceso, que permite…) (La palabra cadena puede tener varios significados 🙂 que lleva a su amplificación de forma exponencial.
Un aptámero es un oligonucleótido sintético, ADN o ARN, capaz de unirse a un ligando específico gracias a su estructura tridimensional. Su selectividad y sus propiedades de unión a ligandos permiten comparar los aptámeros con los anticuerpos.
Referencias:
Aubret M, Savonnet M, Laurent P, Roupioz Y, Cubizolles M and Buhot A
Desarrollo de un innovador ensayo de cuantificación basado en sándwich de aptámero y amplificación exponencial isotérmica con mancuernas.
Química Analítica, 2022.
Brevet: Savonnet M, Buhot A, Cubizolles M, Roupioz Y.
Método para detectar y opcionalmente cuantificar un analito con un oligonucleótido doble tallo-bucle y dicho oligonucleótido.
FR3108124A1.
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